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低酸素プローブ

HT-29などの細胞スフェロイドは内部が低酸素になることが報告されています。
低酸素のセンシングにはHypoxia-responsible elementの下流にGFP遺伝子を組み込んだレポータジーンアッセイやpimonidazoleの低酸素部位への集積性を応用した免疫染色法が一般的ですが、安定発現株の樹立あるいは切片作製・染色作業などの操作は煩雑です。
今回発売する低酸素プローブLOX-1を用いた低酸素センシングは、測定1日前に培地に添加するだけの、余剰な試薬の洗浄操作の要らないホモジニアスなアッセイ方法です。
本試薬によるスフェロイド内部の低酸素度は、一般的な蛍光顕微鏡下の観察により検出可能です。

製品名 Cat.# 容量 保管温度 参考資料
低酸素プローブ LOX-1 2mg 室温 Handbook
MSDS

【細胞内の低酸素センシング(HIF-1α発現レベルとの比較)】

01

単層培養されたSCC-7を20~2.5%の各酸素濃度条件下で24時間培養した後、低酸素プローブLOX-1を培地に最終濃度50μMで添加して酸素センシングした場合、HIF-1αの免疫染色と同等な結果が得られます。
(Zhang et al., Cancer Research 2010)

【スフェロイド内部の低酸素センシング】

01

NanoCulture Plateで6日間培養した各種細胞のスフェロイドの培地に低酸素プローブLOX-1を添加し(最終濃度2μM)、その1日後に蛍光顕微鏡で観察しました(G-2Aフィルターブロック:EX510-560、DM575、BA590)。
HT-29やBT474など、いわゆる”固い”スフェロイドの内部は低酸素となり、PANC-1やMIAPaCa-2のような凝集性の低いスフェロイドの内部は低酸素になりにくいことが確認できました。

【低酸素プローブLOX-1の性質】

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スペクトル特性
吸収スペクトルを緑、りん光スペクトルを赤で示しています。
吸収とりん光はそれぞれ483nm、616nmで最大となります。
(Zhang et al., Cancer Research 2010)

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りん光の酸素消光
酸素雰囲気下では、低酸素プローブLOX-1は共存する酸素のクエンチング効果により、りん光が消光していますが、低酸素になると赤色のりん光を発するようになります。
データご提供:群馬大・飛田教授

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低い細胞毒性
4種類の細胞懸濁液に低酸素プローブLOX-1を各種濃度で添加してNanoCulture Plateで培養しました。
培養7日後にATPアッセイによる細胞毒性の評価をした結果、低酸素プローブは、すべての細胞に対して2μMまでは細胞障害性を示さないことが確認されました。