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技術サポート

スフェロイドからの RNA 抽出
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目的

NanoCulture Dish で 3 次元培養して形成されたスフェロイドからトータル RNA を抽出する方法を紹介します。

試薬材料

1. 細胞
HT-29(ヒト大腸がん細胞株) ATCC® HTB-38™
2. 試薬
培地 McCoy’s 5a supplemented 10%FBS and antibiotics
(FBS は非働化してください)
QIAshredder QIAGEN Cat# 79654 又は 79656
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN Cat# 74134 又は 74136
3. 材料
NanoCulture Dish MH pattern,
低接着, 35 mm
: SCIVAX LS Cat# NCD-LH35

実験例

【3 次元培養】

1. NCD に培地(2 mL/dish)を加える。
2. ピペッティングにて気泡を除去する。
3. 安全キャビネット内又は CO2インキュベータ内で 15 ~ 20 分間静置する(ボトムのマイクロパターン内に発生したマイクロバブルの除去のため)。
4. このディッシュから培地(1 mL/dish)を抜き取る。
5. 細胞懸濁液を調製する (密度:1×105 cells/mL)。
6. 細胞懸濁液を NCP に播種する (2×105 cells/2 mL/dish)。
トータル培養液量は 3 mL/dish となります。
ピペットチップでボトムに傷を付けないように注意してください。その部分だけ単層培養になるなど培養状態に影響する可能性があります。
7. 播種した細胞が沈んでボトムに接着するまで 20 ~ 30 分間、安全キャビネット内で静置する。
8. ディッシュ付属のインサートをセットする。
9. 5%CO2, 37℃で任意の期間インキュベートし、スフェロイドの形成を確認する。

【トータル RNA 抽出】

10. ディッシュ内の細胞をピペッティングでチューブに回収する。
11. 培地(1 mL)で洗い込み、計 4 mL の細胞懸濁液を得る。
12. 4℃、300 xg で 5 分間遠心後、上清を除去して細胞ペレットを得る。
13. RNeasy Plus Mini Kit を用いて total RNA を抽出する。
細胞ペレットに Buffer RLT Plus(β-ME 添加済み)を加えて可溶化する。
QIAshredder でスピンダウンしてライセートを調製する。
QIAGEN 社のプロトコールに従い RNA を精製する。
14. 抽出した RNA は次の濃度測定及び品質評価を行い、ディッシュあたりの RNA 回収量を求める
RNA 濃度
A260/A280 値
rRNA 比(28S/18S)

結果例

【各種容器による回収トータル RNA 量の目安】

35 mm dish 24-well plate 96-well plate 384-well plate
標準播種細胞数 200,000
cells/dish
60,000
cells/well
10,000
cells/well
30,000
cells/well
トータル RNA
回収量
(一週間培養後
の目安)
2-6
µg/dish
0.6-1.8
µg/well
0.1-0.3
µg/well
0.03-0.1
µg/well