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スフェロイドの増殖曲線作成(ATP assay)
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目的

NanoCulture Plate を用いた 3 次元培養における細胞増殖曲線の作成法を紹介します。
スフェロイドの増殖アッセイでは、試薬の細胞膜透過性等の問題で様々な制限が存在します。SCIVAX ライフサイエンスでは、最も簡便で、再現性及び精度が高い方法として ATP assay を推奨しています。ここではヒト肝臓がん細胞株 HepG2 を事例として紹介します。

試薬材料

1. 細胞
HepG2 ATCC Cat# HB-8065™
2. 試薬
培地 EMEM supplemented 10%FBS and antibiotics
(FBS は非働化してください)
CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay Promega Cat# G7570
3. 材料
NanoCulture Plate MS pattern,
低接着, 96-well
SCIVAX LS Cat# NCP-LS96
(4 枚:測定日ごとに 1 枚ずつ必要)
4. 機器
発光プレートリーダー TECAN infinite M200 又は同等品

実験例

【3 次元培養】

1. 培地 50 µL/well を NCP に添加する。
2. 1,000xg で 5 分間遠心する(気泡除去のため)。
3. 安全キャビネット内又は CO2インキュベータ内で 15 ~ 20
分間静置する(ボトムのマイクロパターン内に発生したマイクロバブルの除去のため)。
4. HepG2 懸濁液を調製する (密度:2×105 cells/mL, = 1×104 cells/50 µL)。
5. HepG2 懸濁液を NCP に播種する (1×104 cells/50 µL/well)。
トータル培養液量は 100 µL/well となります。
ピペットチップでボトムに傷を付けないように注意してください。その部分だけ単層培養になるなど培養状態に影響する可能性があります。
6. 播種した細胞が沈んでボトムに接着するまで 20 ~ 30 分間、安全キャビネット内で静置する。
7. エッジ効果を低下させる目的にウェル間の間隙に滅菌水 約 100 µL を添加する。
8. 5%CO2, 37℃でインキュベートする。
9. 播種 1、3、5 及び 7 日後に顕微鏡での形態観察及び ATP 濃度測定を行う。

【CTG 試薬の調製】

10. CTG Buffer 及び CTG Substrate を混合した後、小分けして-20 で冷凍保存する。
11. 使用時に解凍する。

【検量線検体の調製】

12. ATP 標準液の希釈系列を水で調製する。
13. 培地 (90 µL) 及び CTG reagent (100 µL) を実サンプルの入った NCP のブランクウェルに添加する
ATP assay は環境温度の影響を受けやすく、実サンプルと同じプレートに検量線サンプルをおくことを推奨します。
培地中の ATPase により ATP が分解することから、培地及び CTG 試薬の混合液を ATP 標準水溶液に添加することを推奨します。
14. ATP 標準液を⑬に添加する。

【ATP assay】

15. CTG reagent (100 µL) を NCP に添加する。
16. プレートミキサーで 10 分間攪拌後、37℃で 20 分間静置する。
17. 発光測定する。
18. 検量線検体の ATP 濃度に対して発光量をプロットして検量線を作成し、実サンプルの ATP 量を算出する。

結果

Cell Proliferation Curve of HepG2 and Microscopic Images